IHC全攻略 ：问题到底出在哪儿？

可能原因

对策

缺乏抗原

通过原位杂交检查蛋白表达。

因储存不当，抗体不起作用

按照说明书上的说明储存。一般来说，将抗体分装成小份，足够单次实验使用。将这些抗体储存在手动除霜的冰箱中（-20 to -70 °C），避免反复冻融。

一抗或二抗失活

独立检测报告系统，以评估试剂是否有用。

组织固定不足

尝试增加固定时间或换一种固定剂。

组织过度固定

减少浸润或固定后步骤的持续时间。如果浸润固定无法避免，那么通过抗原修复试剂，让抗原不被遮蔽。

一抗与二抗不兼容

使用能与一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗来自兔子，那么就使用抗兔的二抗。

在固定或包埋过程中表位已改变

通过各种抗原修复技术尝试恢复免疫反应性。在58°C或以下包埋组织。

抗原修复不起作用

增加处理时间或改变处理溶液。

试剂遗漏或顺序不对

重复染色过程，确认使用了正确的试剂，并以正确顺序添加。

可能原因

对策

一抗或二抗的浓度高

滴定抗体，以确定促进一抗和二抗的特异反应所需的最佳浓度。

组织中抗体和蛋白的疏水相互作用

降低抗体稀释液的离子强度（特别是单克隆抗体）。

一抗或二抗与组织的非特异结合

在一抗孵育之前采用封闭步骤（通常使用1%  BSA和10% 正常驴血清）。脱脂奶粉也是个选择。

二抗的非特异结合

使用交叉反应性IgG被去除的抗体。

组织变干

在染色过程中避免让组织变干。

离子相互作用引起的背景

提高稀释液的离子强度。

可能原因

对策

抗原修复方法太过剧烈

根据经验确定实验条件，既能保留组织形态，又能恢复抗原的免疫反应性

组织切片从玻片上脱落

增加固定时间。根据经验确定另一种固定剂。

组织切片撕裂或折叠。切片下有气泡

重新切片，或在分析结果时忽略受损区域。

组织形态的分辨率差

切出更薄的组织切片。冰晶可能会破坏冰冻切片的形态。

固定不足在染色过程中会导致组织或细胞受损

延长固定时间。提高固定剂/组织的比例。切出更小的组织，以便更彻底的浸润。

组织自溶导致坏死碎片的染色

延长固定时间、比例。考虑使用交联的固定剂。

可能原因

对策

固定方法不当

尝试另一种固定剂，或延长固定时间。

抗原修复可能不当

尝试另一种抗原修复条件。

抗原的静电荷被改变

尝试调整抗体稀释液的pH或阳离子浓度。

固定拖延导致抗原扩散

快速固定组织。尝试交联固定剂，而不是有机固定剂。